科研進展
Science Advances| 鄭三多實驗室揭示GPCR激活G蛋白的分子基礎
G蛋白偶聯受體（GPCR）作為細胞膜上的鳥苷酸交換因子（GEF），被配體激活后發生構象變化與G蛋白三聚體（α，β和γ亞基）結合，使Gα亞基本來結合的二磷酸鳥苷（GDP）發生解離，隨后細胞質中三磷酸鳥苷（GTP）與Gα亞基結合，導致G蛋白三聚體解離為Gα亞基和Gβγ亞基。這一過程使得G蛋白變成激活狀態 （結合GTP的Gα亞基和解離的Gβγ亞基），并參與下游的信號傳遞。
結構生物學對于理解GPCR激活G蛋白的分子機制至關重要。冷凍電子顯微鏡技術的發展將結構生物學和生物化學帶入一個新的時代，該技術也為GPCR-G蛋白復合物的三維結構研究提供了極大的便利。然而以往的結構生物學研究主要解析了在沒有GDP或者GTP結合狀態下GPCR和G蛋白復合物的結構，這種狀態代表一個在體內存在時間極短但體外穩定的中間狀態。因為GPCR和G蛋白復合物在體外GDP/GTP存在情況下很不穩定，所以一直缺乏在GDP/GTP結合狀態下的高分辨率結構，因此人們對G蛋白激活的機制的理解仍然不全面。
2022年6月10日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究生院鄭三多實驗室在Science Advances雜志上發表題為“Structural insights into G protein activation by D1 dopamine receptor”。該研究通過冷凍電鏡手段解析了D1多巴胺受體（D1R）和Gs復合物在不結合核苷酸、結合GDP、結合GTP等三種狀態下的結構，揭示GPCR激活G蛋白的分子基礎。
首先為了提高D1R和Gs復合物在GDP/GTP存在情況下的穩定性，首先研究人員使用了截斷的Gαs亞基 （mini-Gαs），該截斷體含有結合核苷酸的Ras-like GTPase結構域，缺少了AHD結構域，其次通過融合蛋白手段將D1R的C末端與mini-Gαs的N端連接。通過比較這三種狀態下的結構 （圖1），研究人員發現在G蛋白激活過程中，多巴胺的結合構象是動態變化的，這種變化主要是由于D1R和G蛋白結合界面構象的變化導致的。這些結構反映了GPCR的構象以及GPCR與G蛋白偶聯的動態變化過程。
圖1：多巴胺受體/G蛋白復合物在未結合核苷酸，結合GDP和結合GTP結合狀態下多巴胺的結合模式和結合配體口袋構象的差異。
D1R被多巴胺激活后發生構象變化與結合GDP的G蛋白三聚體結合，它們的結合導致G蛋白C末端的α5螺旋為了插入GPCR內部發生旋轉平移的構象改變（圖2A-2C），α5的構象與不結合核苷酸的D1R-Gs結構和以往解析的GPCR-G蛋白復合物的構象一致。α5的構象變化引起Gα亞基核苷酸結合口袋的殘基V367遠離GDP，減弱了GDP的結合能力。此外V367的移動也削弱了Ras-like結構域和AHD 結構域的相互作用（圖2D和2E），這兩個結構域的分離對于GDP的解離至關重要。另外值得注意的是Gα亞基Ras-like結構域中Q59的旋轉與AHD結構域形成空間位阻，也進一步促進Ras-like結構域和AHD結構域的分離（圖2F）。為了驗證結構發現，研究人員利用GTP 交換實驗來比較多巴胺受體對G蛋白野生型和突變體的激活程度。和預期結果一致，V367A和Q59L突變顯著增強G蛋白的交換速率（圖2G）。
圖2：多巴胺受體與Gs復合物在GDP結合狀態下構象變化揭示GPCR導致Gα亞基中GDP解離的分子機制。
隨著GDP的解離，GTP結合到Gα亞基上。研究人員經過三維分類方法獲得了D1R?Gs復合物與GTP結合的兩個不同構象，一個缺失Nb35，一個結合Nb35。Nb35主要用于穩定GPCR-G蛋白的復合物，但是GTP的結合使得Nb35與復合物脫離。在缺失Nb35的結構當中，GTP的結合引起Gα亞基中switch II的構象改變，進而導致Gα亞基中αN和Gβγ相互作用界面的破壞，最終引起αN朝向受體上翹20° （圖3A-3F）。αN的構象變化在以往所有解析的GPCR-G蛋白復合物結構中都沒有觀察到，但是以前的生物物理和生物化學研究結果表明αN在G蛋白激活過程中發生明顯構象變化。為了進一步證明結構發現，研究人員通過突變破壞αN和Gβγ的相互作用界面模擬激活過程中αN的上翹，發現受體喪失對G蛋白的招募能力 （圖3G）。同樣，在αN-β1 hinge處的一對氫鍵相互作用在GDP狀態下存在，在GTP狀態下由于構象變化消失。當通過突變破壞這對氫鍵相互作用時發現，G蛋白的招募不受影響，但G蛋白的解離速率明顯加快 （圖3H-3J）。
圖3：多巴胺受體/G蛋白復合物GTP結合狀態構象變化。
綜上所述，該研究通過對多巴胺受體G蛋白復合物在未結合核苷酸狀態，結合GDP狀態和結合GTP狀態結構的解析，發現GDP結合狀態是處于結合受體之后GDP釋放之前的中間狀態，表明V367和α1螺旋的構象變化對起始GDP釋放是關鍵的。GTP結合狀態的結構發現switch II的構象改變和αN的上翹是GTP引起受體G蛋白解離的結構基礎 （圖4）。
圖4：D1R激活G蛋白模型。
鄭三多實驗室的博士研究生滕霄，陳思嘉為本文共同第一作者，其他作者包括鄭三多實驗室技術員王曉瑩、黃牛博士和黃牛實驗室的博士研究生王情、陳釗。鄭三多博士為本文通訊作者。該研究由科技部、北京市政府和清華大學共同資助。
