科研進展
Cell Reports | 張二荃實驗室揭示高原鼠兔晝夜節律紊亂的分子機制
哺乳動物生物鐘調節著睡眠-覺醒循環、內分泌、物質能量代謝等多種生理功能，對于生物適應環境具有重要的意義。2017年，張二荃實驗室發現哺乳動物生物鐘與低氧信號通路存在相互調控作用，并揭示其在基因組水平互作的機制。然而，對于生物鐘與低氧信號互作的具體生化機制以及這種互作在生物演化上的意義，仍有待進一步研究。
圖1. 高原鼠兔
2022年5月17日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室聯合蔡濤實驗室、中科院西北高原生物研究所張堰銘實驗室在Cell Reports發表了題為A Highland-adaptation Mutation of the Epas1 Protein Increases Its Stability and Disrupts the Circadian Clock in the Plateau Pika的研究論文。該研究揭示了低氧誘導因子Epas1的穩定性影響高原鼠兔晝夜節律生物鐘的分子機制。
高原鼠兔（Ochotona curzoniae, 圖1）生活在青藏高原及其相鄰地區海拔3000–5000米的高山草甸和高山草原上，是青藏高原數量最多的哺乳動物，對維持青藏高原生態平衡意義重大。它們常年生活在低溫、低氧的極端環境中，是研究低氧適應的理想動物模型。在這項研究中，研究人員首先通過監測高原鼠兔的體溫與活動，發現飼養于高原環境的高原鼠兔的體溫與行為的晝夜節律較弱甚至沒有節律；其細胞和分子層面的生物鐘同樣具有振幅低、節律紊亂的特點（圖2A–C）。
哺乳動物晝夜節律生物鐘的核心振蕩器是由轉錄激活因子Clock/Bmal1和轉錄抑制因子Per/Cry構成的轉錄翻譯反饋回路（Transcription-translation feedback loop，TTFL）。研究人員通過熒光素酶報告基因實驗發現高原鼠兔的Clock、Bmal1、Cry1/Cry2具有正常的轉錄激活/抑制功能，且向小鼠Per2-/-成纖維細胞回補高原鼠兔的Per2可以重建穩定的生物節律（圖2D–E），說明高原鼠兔核心生物鐘基因的自身功能并無異常。
考慮到高原鼠兔長期生活在低氧的條件下，而低氧信號通路又與生物鐘息息相關，研究人員分析了高原鼠兔與平原地區哺乳動物（如家兔、大鼠、小鼠、人等）缺氧誘導因子（HIF）家族蛋白編碼基因的序列，發現高原鼠兔Epas1基因（編碼Epas1蛋白，又稱HIF-2α
）第14個內含子5’端存在一個特異的G>A的點突變。RT-PCR結果表明，該突變會改變Epas1 mRNA的剪接方式，產生增加了72個堿基的轉錄本以及增加了24個氨基酸的蛋白（下稱L-Epas1，未突變的蛋白稱為S-Epas1）。這一突變在弱節律的高原鼠兔中以雜合形式存在，在無節律的個體中則以純合形式存在。全局蛋白質穩定性（Global protein stability, GPS）分析表明，與S-Epas1相比，L-Epas1蛋白在缺氧條件下更加穩定。此外，向家兔、大鼠、小鼠的Epas1蛋白中插入相同的24個氨基酸片段也會提高蛋白質的穩定性（圖3）。
圖2. 高原鼠兔的體溫、活動和離體細胞均無明顯節律，但是其核心生物鐘基因功能正常
圖3. A. 高原鼠兔Epas1基因多態性 B. 24aa的插入導致Epas1蛋白穩定性增加
為了研究Epas1蛋白對生物鐘的影響，研究人員在高原鼠兔細胞中敲低Epas1的表達，發現在無節律的高原鼠兔細胞中敲低Epas1基因可有效恢復細胞的節律性，說明Epas1在破壞高原鼠兔節律中起到關鍵作用。熒光素酶報告基因實驗和凝膠阻滯或電泳遷移率變動實驗（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）表明，Epas1可以和核心生物鐘蛋白Bmal1形成異源二聚體并結合在生物鐘基因的E-box元件上促進基因的轉錄，但Epas1-Bmal1的轉錄激活活性遠遠低于Clock-Bmal1。在平原哺乳動物中，Epas1的穩定性較低，在常氧條件下降解速率快；在高原鼠兔中，由于24個氨基酸的插入，Epas1的穩定性提升，因此可以與核心生物鐘蛋白Bmal1相互作用并干擾生物節律。
為了探究上述結論是否適用于在體情況，研究人員使用CRISPR/Cas9構建了敲入高原鼠兔L-Epas1基因的C57小鼠。將敲入高原鼠兔L-Epas1基因的小鼠的視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus，SCN，哺乳動物生物鐘中樞）進行體外培養，發現敲入高原鼠兔L-Epas1基因使SCN的生物節律對缺氧脅迫更加敏感。通過注射AAV病毒使小鼠在SCN特異性表達高原鼠兔L-Epas1可以使小鼠在低氧環境下體溫節律的穩定性下降（圖4A），進一步證明了Epas1穩定性增加會導致生物節律的紊亂。
將敲入高原鼠兔L-Epas1的C57小鼠在低氧環境中飼養一個月后，發現與敲入了大鼠Epas1或未做敲入的C57小鼠相比，敲入高原鼠兔L-Epas1的C57小鼠面對低氧脅迫時體重下降減少、血液中血紅素含量水平較低、無明顯的心室肥大（圖4B–C）。上述結果說明，突變的Epas1蛋白雖然會導致生物節律的紊亂，但會減少低氧環境下心臟的損傷程度，或許可以解釋L-Epas1在演化過程中被保留的原因。
圖4. A. SCN過表達高原鼠兔Epas1的小鼠體溫節律性變差 B-C. 高原鼠兔的Epas1可以降低低氧環境對心臟的損傷
北京生命科學研究所張二荃實驗室的前博士生劉娜、現博士生田紅妮、虞子青、趙海焦和中科院西北高原生物研究所的李文靖為本文共同第一作者。北京生命科學研究所的張二荃博士、蔡濤博士和中科院西北高原生物研究所的張堰銘博士為本文共同通訊作者。這項研究由科技部、國家自然科學基金委、北京市政府、清華大學和中科院共同資助，在北京生命科學研究所完成。
