Nature Communications | DOPA交聯劑為交聯質譜技術開辟新的應用場景

2022年3月18日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院董夢秋實驗室聯合北京大學雷曉光實驗室和唐淳實驗室，在《Nature Communications》在線發表了題為“Characterization of protein unfolding by fast cross-linking mass spectrometry using di-ortho-phthalaldehyde cross-linkers”的研究論文(DOI:10.1038/s41467-022-28879-4)。該文章報道了一類既可以在近生理條件下，也可以在使蛋白質變性的條件下，十秒鐘快速反應的交聯劑DOPA。DOPA為交聯質譜技術（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry,簡稱CXMS或XLMS）開辟了全新的應用領域，包括捕獲蛋白質變性去折疊的中間態和終態構象，以及追蹤蛋白質構象變化過程。

交聯質譜技術利用化學交聯劑將蛋白質或蛋白質復合體中空間距離足夠接近的兩個氨基酸通過共價鍵連接起來，酶切后用質譜鑒定出交聯肽段和交聯位點，從而獲得蛋白結構信息。由于這一技術簡便高效而且提供的結構信息精確到氨基酸位點，它已經成為輔助解析蛋白復合體三維結構和檢測蛋白-蛋白相互作用的有力工具。

董夢秋實驗室一直致力于交聯質譜技術的開發，與計算科學、有機合成、生物物理等領域的研究者合作開發了pLink系列軟件（pLink, pLink-SS, pLink2），多種交聯劑（Leiker, Diazoker, ArGO and KArGO），以及通過交聯質譜解讀蛋白質動態的方法（open vs closed conformation, specific vs encounter complexes）。此次開發的以DOPA2為代表的鄰苯二甲醛類交聯劑與蛋白質表面的氨基反應，其形成交聯的速度比常用的NHS酯類交聯劑DSS快60-120倍，可實現10秒反應、5秒終止，并且耐受低溫、低pH值、高濃度變性劑如8M尿素和6M鹽酸胍等條件。

DOPA為交聯質譜技術開辟的新應用場景是本文的亮點。作者首先用它分析了單結構域蛋白—金黃色葡萄球菌核酸酶(SNase)—在不同濃度變性劑（0-8M 尿素）中的構象狀態，捕獲到了SNase在2-4M尿素濃度區段從折疊態到去折疊態的轉換，以及圓二色譜和熒光光譜等傳統方法沒有檢測到的、一觸及1M尿素即發生的局部去折疊狀態。

接著，作者以具有多個結構域的牛血清白蛋白（BSA）為研究對象，逐漸增加尿素濃度，用DOPA2交聯質譜技術解析了BSA的變性過程：低濃度（1-2M）尿素破壞BSA單體之間的相互作用，體現在單體-單體之間的交聯迅速降低；單體內不同結構域之間的相互作用也開始受到影響，其程度隨尿素濃度升高而加劇，直至在6M 尿素條件下完全消失；結構域內部的相互作用最為穩定且表現出協同性，相應的交聯在0-4M和6-8M尿素濃度區段都沒有明顯改變，只在4-6M區段大幅度降低。

最后，作者利用DOPA2交聯反應快速發生并可以快速終止的特點對牛胰腺核糖核酸酶A（RNaseA）在8M尿素中的連續變性過程進行追蹤，再結合分子動力學模擬，獲得了RNaseA去折疊中間體的構象集合。

圖1.通過DOPA2交聯質譜技術分析BSA在不同濃度尿素中的變性狀態。

圖2.通過DOPA2交聯質譜技術分析RNaseA在8M尿素中的變性過程。

這些應用實例說明基于快速交聯劑的交聯質譜技術是檢測蛋白質構象變化的靈敏工具。這一工作拓展了交聯質譜技術的應用范圍，代表了該技術從關注狀態到關注過程、從分析靜態到分析動態的升級轉化，為今后的技術發展開辟了新的方向。

董夢秋研究員，雷曉光教授和唐淳教授為本文共同通訊作者。董夢秋實驗室的王建華博士以及雷曉光實驗室的唐毓良博士為本文的共同第一作者。為本工作做出貢獻的還有武漢物理與數學研究所的龔洲博士，馬薩諸塞大學醫學院的RohitJain博士，原董夢秋實驗室的譚丹博士，北京生命科學研究所黃牛實驗室的黃牛研究員、周宇博士，雷曉光實驗室的肖凡、李強博士，中科院生物物理所的葉克窮研究員，以及云南大學的柳樹群教授。經費支持主要來自科技部、基金委和北京市政府。